在上期中，我们深入探讨了同源重组法在质粒构建中的实验步骤。那么，在实际操作中我们需要关注哪些要点呢？接下来，让我们一起仔细了解一下。

一、同源重组法质粒构建中的注意事项

（1）引物设计

同源臂的长度通常应为15-20bp，GC含量最好维持在40%-60%之间。在计算引物的Tm值时，记得仅考虑特异性引物部分，不需包括同源臂和酶切位点。如果引物长度超过40bp，建议在合成时选用PAGE纯化方法，以提高阳性克隆的成功率。

（2）模板选择

当PCR扩增目标片段遇到困难时，可以先使用不带同源臂的引物进行克隆，随后将凝胶回收的产物用作模板，使用带有同源臂的引物进行二次PCR扩增。但请注意，此方法可能会引入较多突变。

（3）酶切与线性化

在使用限制性内切酶对载体进行线性化时，必须确保酶切彻底，可以通过延长酶切时间或采用双酶切的方法来实现。如果选择单酶切，需谨防环状质粒残留导致转化结果不准确。

（4）片段纯化

在凝胶回收时，一定要使用新的刀片，以防外源DNA污染。同时，确保凝胶回收产品的质量和浓度，以便后续精确计算使用量。

（5）比例与用量

需严格遵循最适摩尔比1:2来计算和使用载体与插入片段的量，从而提升重组效率。在使用未经纯化的线性化克隆载体和插入片段扩增产物时，其整体积应保持在反应体系体积的1/5之内。

（6）重组反应条件

重组反应需在冰上配制反应体系，轻轻吸打混匀，避免振荡。反应温度和时间需严格控制，一般为37℃反应约30分钟，反应时间不足或过长可能影响克隆效率。

（7）转化过程

感受态细胞需在冰上解冻，加入重组产品后要轻轻混匀，以免损伤细胞。热激时间和温度必须准确掌握，热激后需要迅速置于冰上冷却。此外，转化产品的涂布量应适中，过多或过少均可能影响阳性克隆的筛选效果，因此可以预先设置涂布的量和浓度。

（8）鉴定环节

在进行菌落PCR鉴定时，需选择合适的引物和PCR程序，确保鉴定结果的准确性。对初步鉴定为阳性的菌落，最好进行测序确认，以最终验证重组质粒的正确性。

二、同源重组法质粒构建中的常见问题

1. 引物设计与胶回收

当胶回收产物浓度不足以进行连接时，可以考虑增加实验的起始量。大多数胶回收试剂盒的回收率仅为30%到60%，因此在载体酶切和扩增片段时可以使用200μl的跑胶体积。

2. PCR产物检测

如果扩增后的PCR产物无条带或条带弱，建议检查引物的Tm值和GC比，并适当更换引物或调整PCR条件以达到最佳效果。

3. 菌落涂布问题

如果涂布后没有菌落或菌落数量很少，可能是线性化克隆载体和插入片段的用量不足或过量，或是比例不当，也可能是因为使用单酶切载体导致的自连现象。建议采取双酶切法，以防自连发生。

4. PCR检测无条带

若在菌液PCR中未见条带，可能是载体连接不成功或引物设计不当导致的。

三、实验相关产品推荐

我们强烈推荐以下实验相关产品：

• 货号：27106; 产品名称：质粒小提试剂盒; 品牌：尊龙凯时; 价格：详询
• 货号：D200596; 产品名称：孔酵母质粒小提试剂盒; 品牌：尊龙凯时; 价格：详询
• 货号：TD407; 产品名称：琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒; 品牌：尊龙凯时; 价格：详询
• 货号：UFC903096; 产品名称：Millipore超滤离心管—30kDa; 品牌：尊龙凯时; 价格：详询
• 货号：MDX006; 产品名称：高特异性高保真Pfu酶预混液; 品牌：尊龙凯时; 价格：详询

以上所有产品均可通过尊龙凯时获得，欢迎就产品和技术问题致电咨询！